Inhoud
- stadia
- Methode 1 Identificeer een bacterie door gramkleuring
- Methode 2 Voer de Ziehl-Neelsen-kleuringstest uit
- Methode 3 Bestudeer het gedrag en uiterlijk van bacteriën
- Methode 4 Interpreteer alle resultaten
De identificatie van bacteriën is een complexe taak. Een van de redenen is dat er volgens schattingen tussen de 10.000 en 1 miljard bacteriesoorten in de wereld zijn! De juiste identificatie van bacteriën is erg belangrijk, vooral op medisch gebied, waar de juiste behandeling van een ziekte grotendeels afhankelijk is van het type microbe dat het probleem veroorzaakt. In de meeste gevallen vindt identificatie plaats op basis van eliminatie. Om een bacterie te identificeren, moet u kleurtests uitvoeren, het uiterlijk ervan analyseren en observeren hoe deze goed reageert op verschillende omstandigheden. Als je snel resultaat nodig hebt, neem dan een DNA-monster om naar een laboratorium te sturen.
stadia
Methode 1 Identificeer een bacterie door gramkleuring
- bepalen als de bacteriën Gram-positief of negatief zijn. Gramkleuring is een methode om bacteriën te verdelen tussen de twee meest voorkomende typen: grampositief en gramnegatief. De eerste hebben een dikke celwand bestaande uit een polymeer genaamd peptidoglycan, dat de beste kleuring heeft als de dunne wanden van gramnegatieve bacteriën.
- Enkele veel voorkomende soorten grampositieve bacteriën zijn streptokokken, stafylokokken, micrococcen (of micrococcen) en listeria.
- Hier zijn enkele veel voorkomende voorbeelden van gramnegatieve bacteriën: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium en Campylobacter.
- Neem passende beschermingsmaatregelen. De bacteriën en chemische elementen die u tijdens de test zult gebruiken, vormen een risico voor uw gezondheid. Draag een veiligheidsbril, wegwerphandschoenen van nitril en een laboratoriumjas tijdens het uitvoeren van de kleurtest. Als je klaar bent, doe je de handschoenen en alle andere verontreinigde materialen in een speciale tas. Vergeet niet de procedures van uw laboratorium te volgen om de zak voor besmette producten kwijt te raken.
- Leg het te observeren monster op een glasplaatje. Plaats een druppel of bacteriemonster op een steriele plaat om met de test te beginnen. Schuif het mes vervolgens drie keer over een bunsenbrander om het monster te fixeren en te voorkomen dat het uit de plaat komt wanneer u de reagentia afspoelt of toevoegt.
- Voeg 5 druppels paars kristal toe aan het mes. Giet vijf druppels kristalvioletoplossing op het monster. Wacht een minuut totdat het monster het kristalviolet heeft geabsorbeerd.
- Houd het mes op zijn plaats met wasknijpers zodat u geen vlekken op uw handen maakt.
- Was het mes grondig om de vlek te verwijderen. Gebruik een kraan of een knijpfles en laat het water gedurende maximaal vijf seconden heel langzaam lopen om inktresten te verwijderen die zich niet aan het monster hebben gehecht.
- Giet vijf druppels Gram Diode Stain op de dia. Het is een oplossing bestaande uit diode, natriumbicarbonaat en kaliumdiodide die ervoor zorgt dat het kristalviolet smelt met de celwanden van de bacteriën. Giet vijf druppels van de oplossing op het monster en laat het een minuut staan.
- Was het monster met alcohol of melkzuur. Alcohol en laceton zijn bleekmiddelen en zullen vlekken van bacteriële celwanden elimineren als ze gram-negatief zijn. Giet een paar druppels bleekmiddel op het monster en laat het niet langer dan drie seconden werken. Probeer daarna vijf seconden voorzichtig met water te spoelen om deze bleekmiddelen te verwijderen.
- Als u het bleekmiddel gedurende een lange tijd laat werken, kan dit leiden tot het verdwijnen van Gram-positieve bacteriënkleuring, wat resulteert in een vals negatief.
- Voer een contrasttest uit met safranin. Safranin is een rode kleurstof die contrasteert met het kristalviolet, waardoor de bacteriën worden gekleurd die niet worden aangetast door paarse vlekken. Giet ongeveer vijf druppels safranin op het monster en laat het een minuut staan. Probeer daarna vijf seconden voorzichtig met water te spoelen.
- Visualiseer uw monster met een vergroting van 1000X. De bacterie wordt paars of paars als het grampositief is, of roze als het gramnegatief is vanwege safranine.
Methode 2 Voer de Ziehl-Neelsen-kleuringstest uit
- Gebruik deze techniek om zuurvaste bacteriën te detecteren. Deze soorten bevatten een grotere hoeveelheid lipiden, waardoor ze beter bestand zijn tegen de kleurstoffen die worden gebruikt bij gramkleuring. De zuurbestendige bacteriën behoren tot het geslacht Mycobacterium, waartoe ook de bacterie behoort die verantwoordelijk is voor tuberculose (M. tuberculosis). Om een zuurbestendige bacterie te verven, moet u een rode kleurstof genaamd carbolic fuchsin gebruiken, bestand tegen spoelen met zure of zwavelzuuroplossingen.
- Neem passende beschermingsmaatregelen. Chemische en biologische materialen die worden gebruikt tijdens het kleuren van Ziehl-Neelsen kunnen gevaarlijk zijn. Daarnaast moet u ook warmtebronnen gebruiken, zoals een Bunsen-mondstuk, een elektrische verwarming of een alcohollamp. Volg de onderstaande instructies om de test uit te voeren.
- Draag een veiligheidsbril, nitrilhandschoenen en een laboratoriumjas.
- Pas op dat u geen dampen van kleurstoffen en bleekmiddelen inademt en laat druppeltjes uw ogen of huid niet spatten. Houd containers open onder een kap.
- Wees zeer voorzichtig bij het opwarmen van het mes. De meeste gebruikte chemicaliën zijn ontvlambaar. Er kunnen ook sporen van brandbare stoffen op de dia's of andere apparatuur aanwezig zijn.
- Bereid het mes voor. Verspreid met cirkelvormige bewegingen gelijkmatig een kleine hoeveelheid van het bacteriemonster in het midden van een steriel glaasje. Uw monster moet ongeveer 10 mm bij 20 mm beslaan.
- Droog het mes. Plaats het mes op de droogstructuur met het monster naar boven gericht. Laat het 30 seconden op natuurlijke wijze drogen. Probeer het mes niet met een doek te drogen.
- Beveilig het monster met warmte. Met het specimen omhoog, schuif het mes twee of drie keer over een verlichte bunsenbrander. U kunt het mes ook op een elektrische kachel plaatsen door de temperatuur ten minste twee uur tussen 65 ° C en 75 ° C in te stellen. Pas op dat u het monster niet kookt of verbrandt.
- Voeg de carbolische fuchsin toe aan het mes. Giet meerdere druppels van deze oplossing op de dia. Giet genoeg om het monster volledig te bedekken.
- Verhit het mes om de kleurstof te fixeren. Verwarm de dia voorzichtig boven een bunsenbrander of een alcohollamp, met het monster naar boven gericht, of plaats deze op een elektrische kachel. Verwarm het mes tot 60 ° C of totdat het stoom begint af te geven. Laat de kleurstof vijf minuten inwerken.
- Als u een elektrische kachel gebruikt, zet deze dan op 60 ° C aan. Als u kiest voor de alcohollamp of de bunsenbrander, kunt u rook verwachten.
- Om het mes vijf minuten op de gewenste temperatuur te houden, verwarmt u het met tussenpozen.
- Pas op dat u het monster niet kookt, verbrandt of droogt.
- Spoel het mes met koud water. Laat het vijf minuten afkoelen en spoel het een paar seconden zachtjes met schoon water. Gebruik leidingwater of een knijpfles om kleurstofvlekken te verwijderen die zich niet aan het monster hebben gehecht.
- Giet op het monster zure alcohol of zwavelzuur. Gebruik een volume van 3 vol.% (Vol / vol) alcohol of 20% zwavelzuur om het monster volledig te bedekken. Laat het zuur werken totdat de kleur vervaagt en een zeer felroze tint bereikt. Het proces duurt meestal ongeveer tien minuten.
- Gebruik schoon water om het mes te spoelen. Was het mes voorzichtig onder een kraan of met een knijpfles. Verwijder alle zuur- en kleurstofresten goed.
- Voeg het contrastmiddel toe. Nadat je de dia hebt gespoeld, giet je de kleurstof malachietgroen of methyleenblauw op. Deze twee oplossingen creëren een blauwachtige of groenachtige achtergrond waarop de rode kleurstof zal verschijnen, evenals andere biologische materialen, zoals menselijke cellen en niet-zuurbestendige bacteriën. Laat de stoffen een tot twee minuten werken.
- Spoel en droog het mes. Spoel grondig met water om overtollig contrast te verwijderen. Als je klaar bent, droog je de achterkant van het mes met een droge doek en laat je het op natuurlijke wijze drogen op een standaard.
- Visualiseer uw monster met een vergroting van 1000X. De zuurbestendige bacteriën worden rood of donkerroze. Andere bacteriën, niet-bacteriële cellen en de basis van het mes worden groen of blauw.
Methode 3 Bestudeer het gedrag en uiterlijk van bacteriën
- Analyseer de vorm van de bacteriën. Na het uitvoeren van de kleuringstest om te bepalen of de bacteriën grampositief, gramnegatief of zuurbestendig zijn, is het tijd om de soort nauwkeuriger te identificeren. Analyseer eerst de vorm van de bacteriën op de dia. De drie meest voorkomende vormen zijn cocci (bolvormig), spiralen en bacillen (staafvorm).
- Er zijn verschillende varianten van deze vormen. Ronde bacteriën (coccus) kunnen bijvoorbeeld in paren (diplococci), in ketens, in hopen of in groepen van vier (tetrads) voorkomen.
- Ontdek of de bacteriën aëroob of anaëroob zijn. Neem twee monsters van bacteriën en creëer twee afzonderlijke culturen. De maan moet anaëroob zijn (zonder zuurstof gekweekt), terwijl de andere aëroob moet zijn (met zuurstof gekweekt). Bewaar de anaërobe kweek gedurende ten minste 48 uur op 35 ° C op een zuurstofvrije plaats voordat groei wordt waargenomen.
- Als bacteriën in een omgeving zonder zuurstof groeien, maar niet bij blootstelling aan zuurstof, betekent dit dat ze anaëroob zijn.
- Hoewel ze zich ontwikkelen in een zuurstofrijke omgeving, maar niet in afwezigheid van zuurstof, zijn ze aerobe.
- Wanneer ze zich in beide omgevingen ontwikkelen, hebben we het over facultatieve anaërobe bacteriën.
- Voer een motiliteitstest uit. Een bacterie is mobiel als hij alleen kan bewegen met een of meer flagella. De mate van motiliteit is erg belangrijk bij de identificatie van bepaalde bacteriesoorten. Er zijn verschillende soorten motiliteit, maar de veiligste en meest leesbare manier is het semi-solide medium.
- Creëer een cultuur voor de motiliteitstest. Bereid een cultuur van bacteriën in een cultuurbouillon. Volg de onderstaande instructies om de bouillon van uw keuze te bereiden.
- Inoculeer de cultuur in een semi-solide agar voor motiliteitstests. Bedek een deel van de bouilloncultuur met een steriele inoculatienaald. Zet de naald voorzichtig in de halfvaste dagar-buis, zoals TTC lagar, die u voor de test hebt voorbereid. De naald moet 2/3 van de agar doordringen.
- Wanneer u klaar bent, verwijdert u de naald voorzichtig en pas op dat u de grenzen van de inentingszone niet overschrijdt.
- Incubeer de buis 48 uur bij 30 ° C.
- Lees het testresultaat. De agar voor de motiliteitstest wordt rood bij contact met bacteriën. Als ze mobiel zijn, zal deze rode of roze tint zich door de stof verspreiden. Anders zal de kleuring beperkt blijven tot de injectieplaats.
Methode 4 Interpreteer alle resultaten
- Verzamel uw opmerkingen. Om het soort bacteriën te kennen, moet u de informatie verzamelen die is verkregen uit de culturen, de kleurtesten en de observatie van de vormen. Als u de monsters van een patiënt onderzoekt, kunnen de symptomen die deze vertonen ook helpen bij het bepalen van het juiste type bacterie.
- Als de tests bijvoorbeeld aantonen dat de bacteriën gram-negatief, anaëroob, niet-beweeglijk zijn en u symptomen zoals buikpijn, misselijkheid en braken bij de patiënt opmerkt, is het waarschijnlijk dat de patiënt lijdt aan een bacterie-infectie. fragilis.
- Raadpleeg een database. Er zijn duizenden soorten bacteriën in de wereld. Het is onmogelijk om alles uit het hoofd te weten. U zult waarschijnlijk een klinisch microbiologisch boek of een online database moeten raadplegen om testresultaten te vergelijken met informatie over bacteriesoorten.
- Er zijn uitstekende online bronnen voor het identificeren van bacteriën, maar de meeste van deze databases zijn beschikbaar in het Engels, waaronder Patricbrc.org en GlobalRPh. U kunt echter nog steeds nuttige informatie vinden op de INRA International Microbial Resource Center-website.
- Voer een genetische test uit om de exacte bacteriesoort te kennen. In sommige gevallen moet u mogelijk de bacteriesoort identificeren. De snelste en gemakkelijkste methode is om een DNA-test uit te voeren. DNA-tests zijn ook nuttig voor het identificeren van bacteriën die resistent zijn tegen traditionele vormen van kleuring en kweek. Tegenwoordig zijn DNA-tests op micro-organismen erg snel en kunnen ze in minder dan twee uur klaar zijn.
- Als u geen toegang hebt tot een laboratorium dat genetische sequenties van micro-organismen uitvoert, stuurt u een bacteriemonster naar een gespecialiseerd bureau.